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Imágenes en tiempo real muestran cómo el SARS-CoV-2 ataca las células humanas

Imágenes de una sola molécula de ACE2-GFP HEK293T tratada con QD608-RBD

Los receptores ACE2 son proteínas de células humanas que abren efectivamente la puerta al ataque

"Lo que estamos haciendo aquí es visualizar la unión de la espiga a las ACE2 [enzima convertidora de angiotensina 2]", dice Kirill Gorshkov, científico investigador del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS) en Maryland, EE. UU.

Aunque esto pueda parecer inofensivo para los no iniciados, esta unión es el primer paso en un proceso de proliferación viral que puede haber llevado a la peor pandemia que se recuerde. La "espiga" es una proteína del virus SARS-CoV-2 que se reconoce ampliamente como el arma principal de ataque para movilizar su ADN viral en una célula huésped. Los receptores ACE2 son proteínas de células humanas que abren efectivamente la puerta a este ataque.

Usando puntos cuánticos de bioingeniería, Gorshkov y Eunkeu Oh en el Laboratorio de Investigación Naval (NRL) en Washington, DC, y sus colegas pudieron obtener imágenes de la unión y posterior internalización que tiene lugar cuando interactúan las ACE2 y la proteína de espiga. "De hecho, se puede ver que eso sucede en tiempo real", agrega Gorshkov, "Esa es la belleza de este ensayo y por eso creemos que será importante para la detección de medicamentos".

Ataque espiga SARS-CoV-2 Ataque espiga SARS-CoV-2

Un virus no puede reproducirse sin inscribir una célula anfitriona, por lo que investigadores de todo el mundo han estado trabajando para comprender cómo interactúa y penetra en las células el SARS-CoV-2 con el objetivo de bloquear esta etapa y prevenir la aparición de COVID19. Gorshkov y sus colegas en NCATS ya estaban trabajando en varios ensayos de imágenes para cánceres, virus y enfermedades de almacenamiento lisosómico, "pero cuando golpeó el coronavirus, rápidamente tuvimos que cambiar de marcha", dice Gorshkov.

Investigaciones anteriores sobre el SARS habían destacado la importancia de las interacciones con las ACE2 en las células humanas para la propagación de este tipo de virus, y ya podían etiquetar estas proteínas receptoras con una proteína verde fluorescente para visualizar sus movimientos. También se estaba acumulando evidencia para identificar las proteínas de espiga específicas en el SARS-CoV-2 que podrían estar bloqueando a las ACE2 en una fortaleza para que el virus pueda ingresar a la célula.

Sin embargo, la información sobre las interacciones de las proteínas de espigas se ha acumulado en su mayoría indirectamente a partir de ensayos bioquímicos o de proximidad y pruebas con proteínas y partes de proteínas extraídas del virus, las "pseudoviropartículas". Sin marcaje fluorescente de estas proteínas virales, su papel en la unión del receptor ACE2 y la subsiguiente internalización (endocitosis) continuó desempeñándose eficazmente en las imágenes al amparo de la oscuridad.

En el NRL, los investigadores también estaban interesados ​​en aprovechar su experiencia con nanopartículas para la entrega celular y la biosensibilidad para ayudar en los esfuerzos en la búsqueda de medicamentos anti-COVID19. Oh comenzó a buscar posibles formas de aplicar las técnicas de conjugación proteína-nanoestructura con las que había estado trabajando durante más de 15 años. Con dos proteínas que comparten una afinidad de unión (un punto cuántico unido a una y una nanopartícula fluorescente adherida a la otra), la unión entre las dos proteínas acercará las nanoestructuras lo suficiente para que se transfieran energía entre ellas.

La extinción de la fluorescencia resultante permite a los investigadores controlar la unión de proteínas. "Si tiene algún inhibidor en el medio para detener la unión, esto puede usarse como un ensayo de inhibición para la detección de medicamentos, por lo que lo usamos mucho", explica Oh. Al ver la posible aplicación para la detección de anticuerpos contra COVID19, Oh y su equipo dirigido por Mason Wolak presentaron sus ideas al equipo de NCATS, y las dos instituciones se pusieron manos a la obra para desarrollarlo aún más.

propiedades nanoparticulas

Imagen: Diseño de ensayos y propiedades físicas de nanopartículas. (a) Diagrama esquemático del ensayo bioquímico que utiliza la transferencia de energía de QD-RBD a AuNP-ACE2 (arriba a la izquierda) y el ensayo celular que utiliza la interacción QD-RBD con ACE2 (con o sin modificación de GFP al final del C-terminal) en la membrana celular (arriba a la derecha).

Desarrollando un "pseudovirion"

El primer paso del lado de la colaboración de Oh fue desarrollar un "pseudovirion" con las partes potentes de las proteínas de espiga del SARS-CoV-2 (donde se encuentra el dominio de unión al receptor) unidas al punto cuántico de tal manera que las proteínas de espiga continúan atacando y penetrando las células como un virus activo.

Para ello, fue clave la orientación de las proteínas de espiga y la forma del pseudovirion, y aquí, la amplia experiencia de Oh conjugando proteínas activas con nanoestructuras valió la pena. Antes de pasar a las pruebas de entrega celular más caras, tuvieron que probar si su pseudovirion funcionaba fuera de las células conjugando nanopartículas de oro fluorescentes a los receptores ACE2 y monitoreando la extinción de la fluorescencia. Oh enumera las múltiples proporciones de proteína a punto cuántico.

Para observar el pseudovirion interactuando con las ACE2 en una célula real, el punto cuántico en el pseudovirion necesitaba ahora ser diseñado para emitir a una longitud de onda que fuera fácil de distinguir de la proteína verde fluorescente en las ACE2, en lugar de optimizar la extinción de nanopartículas. Con las dos señales claras, el equipo de NCATS pudo rastrear la unión de las dos proteínas y la posterior endocitosis.

Además, pudieron ver que la unión y la endocitosis se prevenían en presencia de dos anticuerpos de prueba. Incluso podrían probar el mecanismo de endocitosis, que procede por medio de una proteína llamada dinamina. Cuando agregaron Dyngo-4a, que interrumpe la dinamina, pudieron ver que se produce la unión, pero no una endocitosis posterior.

Los resultados también apuntan a un éxito para las colaboraciones de investigación remota, ya que los equipos nunca se conocieron. "El tipo de colaboración que tenemos aquí es poco común", dice Gorshkov, reflejando cuánto superó su progreso las colaboraciones anteriores donde había habido un mayor número de reuniones físicas y actividades coordinadas. "Hubo tal impulso y tal enfoque de ambos grupos que realmente se sinergizó muy bien".

El pseudovirión de punto cuántico se limita a obtener imágenes de la penetración celular por endocitosis, y queda por determinar si este mecanismo entra en vigor para todos los tipos de células, en particular el tejido pulmonar.

Un mecanismo de ataque alternativo del SARS-CoV-2 se basa en la fusión de membranas, y obtener imágenes de esto con el pseudovirion de punto cuántico requeriría modificaciones significativas para interactuar con la célula más como una membrana. Sin embargo, el rápido rendimiento y las observaciones directas que permite el pseudovirion de punto cuántico deberían presentar ventajas significativas en la búsqueda de anticuerpos.

La investigación se publicó en la revista ACS Nano: Quantum-Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Pseudo-Virions Enable Tracking of Angiotensin Converting Enzyme 2 Binding and Endocytosis

Vídeo de cabecera: Lapso de tiempo de obtención de imágenes de una sola molécula de ACE2-GFP HEK293T tratada con QD608-RBD 200 pM en el canal QD608-RBD

Modificado por última vez enMiércoles, 09 Septiembre 2020 10:46